不同消毒剂对禽舍细菌气溶胶多样性的影响

        为了更好地了解不同消毒剂对肉鸡舍微生物种类和数量的影响，使用了臭氧、有效氯、季铵盐、戊二醛和混合消毒剂等五种不同类型的消毒剂。通过高通量测序结合空气采样分析肉鸡舍微生物群落。结果表明，与未使用消毒剂的鸡舍相比，施用不同消毒剂的空鸡舍空气中需氧菌浓度显着降低（P < 0.05或P< 0.01), 消毒后可吸入空气中需氧菌颗粒数急剧下降。在五种消毒剂中，混合消毒剂对总微生物群落的消毒效果很好（P < 0.05）。高通量测序共获得508143个高质量序列，确定了1995个可操作的分类单元。总共鉴定出 42 个门和 312 个属。施用不同消毒剂后肉鸡舍内空气中微生物群落结构不同。在混合消毒剂处理的房屋中，微生物群落中含有机会致病菌，如大肠杆菌、志贺氏杆菌、芽孢杆菌和假单胞菌，丰度很低，与未经消毒剂处理的房屋相比，丰度显着降低。α多样性指数显示，混合消毒剂处理的鸡舍内微生物群落多样性较低。与其他四种消毒剂相比，混合消毒剂处理过的房屋的空气样本中仅检测到少量细菌；具体来说，只发现了四个门（变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门）。混合消毒剂对四个门类的消毒产生了积极的影响；但是，它并没有彻底消除它们。在属水平上，芽孢杆菌属、Arenimonas和Shinella用混合消毒剂处理过的鸡舍检测不到，用其他消毒剂处理过的鸡舍检测到。高通量测序结果表明，多种消毒剂联合使用具有良好的消毒效果，该技术可以对肉鸡舍的空气进行消毒。这些结果将有助于指导制定合理的肉鸡舍消毒方案。

介绍

近年来，随着畜牧业和养殖业集约化程度的不断提高，圈养动物的密度不断增加。此外，动物传染病的传播正在加速，各种动物流行病已经出现（Wu et al., 2012 ; Mellata, 2013 ; Mughini-Gras et al., 2014 ; Threlfall et al., 2014 ; Barbosa et al. ，2017 年；Poulsen 等人，2017 年；Stromberg 等人，2017 年；Vinayananda 等人，2017 年）。因此，畜禽舍的消毒已成为防治疾病的重要措施。肉鸡舍常用的化学消毒剂包括有效氯、臭氧、季铵盐和戊二醛（Meroz 和 Samberg，1995 年；Saklou 等人，2016 年；Chidambaranathan 和 Balasubramanium，2017 年）。用于肉鸡舍大规模消毒的不同消毒剂作用机制不同，因此其消毒效果也不同（Suwa et al., 2013 ; Chidambaranathan and Balasubramanium, 2017 ; Maertens et al., 2017））。目前，含氯化合物（二氯异氰尿酸钠、次氯酸钠、漂白粉、二氧化氯等）广泛用作畜禽生产中的消毒剂（Van Klingeren，1995；Boxall等，2003）。有效氯能有效杀灭结核杆菌、肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。低浓度的尼日尔孢子（Boxall 等人，2003 年；Hakuno 等人，2010 年；Suwa 等人，2013 年）。

        许多研究表明，含氯化合物可以通过改变微生物的细胞膜结构来杀死微生物（Venkobachar et al., 1977 ; Virto et al., 2005 ; Liu et al., 2006 ; Berg et al., 2010）。臭氧是一种三原子气态分子，可作为强氧化剂，已在医学中使用了 150 多年（Elvis 和 Ekta，2011 年）。臭氧因其有效的抗菌功能 ( Ozturk et al., 2017 ) 和抗氧化防御 ( Delgadoroche et al. , 2017) 而具有广泛的医疗应用）。革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌对臭氧更敏感，而细菌比测试过的酵母菌株更敏感（Moore 等人，2000 年）。雅各布斯和海德堡 (1915)首次合成具有杀菌能力的季铵盐化合物。季铵盐的杀菌机制涉及改变细胞通透性，导致细菌内容物外渗。季铵盐是一种阳离子表面活性剂。鉴于阳离子表现出基于亲脂性的杀菌作用，并且革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌含有更多的脂质，因此革兰氏阳性菌更容易被季铵盐灭活。戊二醛可以直接作用于细菌的蛋白质和酶，从而影响细菌的新陈代谢，导致细菌死亡。戊二醛还可以防止细菌孢子外层释放二盐酸盐，防止孢子形成。所以，Battersby 等人，2017 年；卡斯特罗等人，2017 年）。戊二醛杀菌谱广，对细菌和病毒具有高效杀灭能力。戊二醛对梭状芽孢杆菌产生的孢子也有很强的作用，可引起坏死性肠炎，因此常用于流行病期间细菌孢子的消毒（Miner et al., 1993 ; Rutala et al., 1993 ; Brantner et al . ., 2014 年）。

        在集约化养殖过程中，家畜和家禽可以通过粪便和呼吸道排出细菌和病毒，包括机会性病原体，并在空气中产生生物气溶胶，可能危害人类和环境（Hojovec 和 Fiser，1968 年；Bessarabov 等人， 1972 年；Petkov 和 Tsutsumanski，1975 年；Petkov 和 Baĭkov，1984 年；Petkov 等人，1987 年；Just 等人，2011a，b）。鸡被转移或淘汰后，空的肉鸡舍受到不同程度的污染。空屋消毒是规模化养鸡场防治疾病的重要一步。消毒可以减少或杀死鸡舍内潜在的病原微生物，防止病原微生物在批次间传播。不同的消毒程序有不同的效果，因此选择合适的消毒剂以及消毒程序和方法可以有效控制禽舍传染病的发生。这些方法主要包括清洗、浸泡、熏蒸、喷涂和紫外线照射。雾化消毒剂已经应用了半个多世纪。气溶胶可以节约材料，形成消毒气溶胶-消毒剂蒸气系统（Wichelhaus 等人，2006 年；卡瓦略等人，2015 年；Saklou 等人，2016 年）。应用超声雾化技术，可将液体雾化成气溶胶状态，获得均匀分散的2~4 μm液滴。雾化后的液滴起到“种子粒子”的作用，在气溶胶中形成聚集核，可以与周围的细小颗粒有效碰撞，提高聚集效率。消毒剂雾化后，空气中散发出大量水蒸气，增加室内相对湿度，提高消毒剂对细菌壁的渗透能力，增强消毒效果，减少消毒时间（Muñoz等., 2017 年）。

        理想的消毒剂应具有良好的杀灭病原微生物的能力；性质稳定，不易受水质、有机物等物理化学因素的影响；有效控制养鸡场环境卫生。因此，检测空屋消毒后残留的微生物是评价消毒效果的重要手段。许多方法可用于微生物气溶胶检测，例如微生物培养计数、直接显微检测、生物传感器技术和基因芯片技术。这些方法是传统的，无法准确检测不易培养或空气中含量低的微生物。高通量 DNA 测序方法可用于通过 16S rRNA 序列分析来表征微生物系统。(Korajkic 等人，2015 年；贾等人，2016 年）。该技术的优势在于能够检测培养方法难以获得的微生物；因此，该技术已广泛应用于许多领域（O'Brien et al., 2014 ; Tian et al., 2017）。高通量测序技术可用于评估消毒对空屋内微生物分布和微生物群落结构的影响。本研究采用五种常用消毒剂对禽舍进行消毒。通过 16s rRNA 的高通量测序分析了处理后存在的微生物群的组成，并与未处理房屋中的微生物群进行了比较。研究了不同消毒剂对空置肉鸡舍内微生物数量和多样性的影响。本研究为消毒剂在疾病预防中的正确应用和消毒程序的制定提供参考。

结果与分析

消毒剂处理和未处理的肉鸡舍内好氧菌的含量和粒径分布

未经处理和用消毒剂处理的肉鸡舍中的气溶胶浓度如图2所示。经过处理的房屋的细菌负荷低于未经处理的房屋。经不同消毒剂处理后，有效氯和混合消毒剂处理的肉鸡舍细菌气溶胶浓度很高和很低，分别为7.67×10 2 cfu/m 3和0.22×10 2 cfu/m 3。显然，混合消毒剂对培养细菌的效果优于其他四种消毒剂（P < 0.05）。

图 1.未经处理和经消毒剂处理的空气中的细菌总数 ( n = 9)。A：无需消毒；B：臭氧；C：有效氯；D：季铵盐；E：戊二醛；F：混合消毒剂。

如表1所示，与未经处理的鸡舍相比，经消毒剂处理的肉鸡舍中空气中需氧菌的粒径分布发生了显着变化。从 Andersen-6 集尘器的 III-VI 阶段开始，用不同消毒剂处理的肉鸡舍中空气中需氧菌的分布有所减少。与未用消毒剂处理的空鸡舍相比，有效氯、季铵盐、戊二醛和混合消毒剂消毒的肉鸡舍在Ⅲ~Ⅵ阶段的分布显着降低。在混合消毒剂处理的肉鸡舍中，V-VI阶段空气中需氧菌的比例较消毒前的比例从35.1%显着下降到0%，戊二醛从35.1下降到1%。

表 1.未经消毒剂处理和处理过的细菌的分级分布。

通过高通量测序进行序列分析

在对空气传播细菌中细菌 16S rRNA 基因的 V4-V5（515F-907R）区域进行测序后，样本中的原始序列总数为 531,093。过滤低质量序列后，有效序列总数为508,143。在对序列进行质量控制后，将序列聚类到 OTU 中，以 97% 的同一性进行分类。所有样本共产生 1995 个 OTU（补充表S1），平均长度为 372 bp。每个样品的序列信息如表2 所示。

表 2.样品的序列信息。

微生物群落结构分析

在微生物分类门水平（图2A)，未处理或经五种消毒剂处理的肉鸡舍内采集的空气传播微生物主要包括变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门。这些门经臭氧、有效氯、戊二醛和混合消毒剂处理后占优势，相对丰度分别为99.0、97.9、99.8和99.9%。未经消毒剂处理或消毒剂处理的肉鸡舍中空气传播的微生物在门水平上存在差异。未经处理的鸡舍总共有 32 个门，而用臭氧、有效氯、季铵盐、戊二醛和混合消毒剂处理的肉鸡鸡舍的门数分别为 21、27、28、17 和 6 个. 使用混合消毒剂后OTU的相对丰度很低。

图 2.门水平(A)和属水平(B)的群落分类组成和丰度分布。a、臭氧；b、有效氯；c、季铵盐；d、戊二醛；e、混合消毒剂；f、未经消毒。

微生物群落多样性分析

采用 Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数和 Simpson 指数评估样品中微生物物种的丰度和多样性（表3）。不同样本的多样性指标不同。未经消毒的肉鸡舍的多样性指数高于其他鸡舍的指数，说明未经消毒的肉鸡舍的生物多样性比较丰富。但经混合消毒剂处理后，肉鸡舍样品的Chao 1和ACE丰度指数较其他样品有所下降。混合消毒剂的多样性指数很低，表明其消毒效果优于其他消毒剂。此外，主坐标分析（PCoA）显示各个样本之间存在明显的聚类，来自未处理房屋的样本聚集在一起并与其他处理房屋样本分离（补充图S1）。

表 3.样品中细菌 α 多样性的统计分析。

聚类分析

基于可在门级别分类的 35 种不同分类法构建了热图（图3 ）。图中的每个小方框代表样本中某个细菌门的相对丰度。更强烈的红色代表增加的相对丰度。如热图所示，不同样品中微生物群落的组成不同。未经处理的肉鸡舍空气中微生物群落丰度很高，多种消毒剂联合处理后该丰度明显下降。

图3.门级细菌的相对丰度。a、臭氧；b、有效氯；c、季铵盐；d、戊二醛；e、混合消毒剂；f、未经消毒。热图基于行Z分数进行颜色编码。比例尺是六个样品中细菌相对百分比的标准化Z值。颜色代码表示相对丰度，范围从蓝色（低丰度）到黄色到红色（高丰度）。