低浓度臭氧控制红苹果李斯特菌的有效性研究

        本研究旨在探讨低剂量连续臭氧气体对红冠苹果长期商业冷藏过程中无害李斯特菌和品质属性及病害的控制效果。Red Delicious 苹果以 ∼6.2 log 10 CFU/苹果接种三株无害乳杆菌混合物，用或不用 1-甲基环丙烯处理，然后在商业环境中用或不用连续气态臭氧进行受控气氛 (CA) 储存设施 36 周。将经受上述储存条件的未接种红美味苹果用于酵母/霉菌计数和质量属性评估。36 周的冷冻空气 (RA) 或 CA 储存导致约 2.2 log 10 CFU/苹果减少无害乳杆菌。与单独的 RA 和 CA 存储相比，臭氧气体的应用导致无害乳杆菌的额外 > 3 log 10 CFU/苹果减少。在 36 周的 CA 储存过程中，连续施用低剂量的气态臭氧显着延缓了酵母/霉菌的生长，延缓了苹果的硬度损失，并且对臭氧燃烧、皮孔腐烂、赤褐色、CO 2损伤、表面烫伤、与单独 CA 存储相比，Red Delicious 苹果的软烫。总之，连续应用低剂量气态臭氧有可能控制红美味苹果上的李斯特菌，而不会对苹果的品质属性产生负面影响。

介绍

        单核细胞增生李斯特菌可在易感人群中引起致命的李斯特菌病，并且死亡率很高（CDC，2017）。单核细胞增生李斯特菌广泛存在于农业环境中。美国食品和药物管理局对苹果和其他即食食品实施零容忍（Shank 等人，1996 年；FDA，2008 年）。苹果在开放环境中生长，因此在生产或随后的采后包装过程中可能受到单核细胞增生李斯特菌的感染（ Angelo 等人，2017 年）。单核细胞增生李斯特菌与两次多州焦糖苹果暴发有关（Angelo 等人，2017 年；Marus 等人，2019 年）) 以及多个新鲜苹果品种 ( FDA, 2017 , 2019 ) 和鲜切苹果 ( FDA, 2016 , 2020b ) 的多次召回。这些暴发和召回凸显了苹果李斯特菌污染的风险以及控制苹果李斯特菌的重要性。收获后，苹果通常在受控气氛 (CA) 冷藏库中冷藏长达 12 个月。在这种长期储存过程中进行抗菌干预可以为控制新鲜苹果上的李斯特菌提供潜在的干预策略（ Sheng 和 Zhu，2021 年）。

        臭氧是一种强氧化剂和强效抗菌剂，不会在处理过的产品上留下任何残留物（Guzel-Seydim 等人，2004 年）。臭氧气体被食品和药物管理局批准为公认安全剂（FDA，2020a），并被批准用于有机生产和处理（USDA-NOP，2021）。已经研究了以固定速率在短时间内控制主要食源性病原体的气态臭氧，包括大肠杆菌O157:H7（Han 等人，2002 年）、沙门氏菌（Das 等人，2006 年）和单核细胞增生李斯特菌（Alwi 和 Ali，2014 年；Concha-Meyer 等人，2014 年) 新鲜农产品。例如，10 mg/L 的臭氧气体可在1 小时内使番茄上接种的肠炎沙门氏菌减少约 7 log 10 CFU/番茄（Das等人，2006 年）。在 4°C 下储存 10 天后，新鲜蓝莓上的 4 mg/L 气态臭氧可将单核细胞增生李斯特菌减少 3 log 10 CFU/ml（ Concha-Meyer 等人，2014 年）。20 分钟的气态臭氧 (23 mg/L) 暴露导致帝国苹果上单核细胞增生李斯特菌的 2.1–3.1 log 10 CFU/苹果减少（Murray 等人，2018 年）。还研究了臭氧气体以控制不同苹果品种在储存期间的常驻微生物群（Yaseen 等，2015）。在 1°C 储存条件下，暴露 0.5 mg/L 的臭氧气体 60 天会导致新鲜苹果上的扩展青霉减少 2.7-4.0 log ，具体取决于品种（Yaseen 等人，2015 年）。

       此外，在储存期间使用臭氧气体有利于保持水果品质。例如，据报道，1-3 毫克/升的臭氧暴露可保持苹果的硬度（Antos 等人，2018 年）并减少苹果的重量损失（Juhnevica-Radenkova 等人，2019 年）。我们之前表明，在 CA 储存中连续应用 30 周 87 μg/L 的气态臭氧可将富士苹果上李斯特菌减少 5.0 log 10 CFU/苹果，而不会对苹果果实质量产生负面影响。盛等人，2018）。然而，这种影响不能直接转移到其他苹果品种，因为每个苹果品种都有其独特的表皮蜡和常驻微生物群组成，这些成分会影响李斯特菌的持久性和对抗菌干预的反应（Chai 等人，2020 年；Ku 等人，2020 年；Abdelfattah 等人）等，在新闻中）。

        Red Delicious 苹果是美国很畅销的苹果品种之一（USAA，2019 年），很近因潜在的单核细胞增生李斯特菌污染而被召回（FDA，2019 年）。与其他商业化种植的苹果品种相比，Red Delicious 苹果特别容易出现水核，在长期 CA 储存期间发生内部疾病（例如内部褐变）的风险增加（Mattheis，2008 年），进一步导致苹果产业遭受损失。本研究的目的是研究不同商业储存方式与不同剂量的连续气态臭氧在控制无害李斯特菌方面的效果，在有或没有 1-甲基环丙烯 (1-MCP) 预处理的 Red Delicious 苹果上与L. monocytogenes ( Buchrieser et al., 2003 ) 在系统发育上相关。进一步评价了红冠苹果在不同贮藏条件下品质属性的维持情况。

材料和方法

无害李斯特菌培养准备

        两种L. innocua 食品分离物，NRRL 33314 和 NRRL 33554，以及一种加工厂分离物L. innocua，NRRL 33197，来自 USDA-ARS 培养物保藏中心 [National Center for Agriculture Utilization Research (NRRL), Peoria, IL, United州] 并储存在添加 0.6% 酵母提取物 (TSBYE；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, United States) (TSBYE) 和 20 -80°C 下的 % (v/v) 甘油。每个冷冻培养物在 TSBYE 中在 37°C 下连续转移两次 24 小时。通过组合等量的单个L. innocua菌株来制备三菌株鸡尾酒接种物。个体L. innocua通过在 TSAYE（含 1.5% 琼脂的 TSBYE）板上连续稀释和铺板来计数菌株或三菌株混合物。

苹果接种

        新鲜未上蜡的红美味苹果，在商业成熟时手动收获，康奈尔淀粉指数显示范围为 2.8-3.5（Blanpied 和 Silsby，1992 年），储存在商业储藏室（亚基马，华盛顿州，美国），温度为 ∼ 1°C 并在研究前送到实验室。本研究选择了没有割伤、瘀伤或疤痕的苹果（~200 克）。对于L. innocua接种，将苹果浸入在无菌磷酸盐缓冲盐水（1 × PBS，pH 7.4）中稀释的三株L. innocua接种物中，以获得约 6.2 log 10的接种水平CFU/苹果。接种后的苹果在室温（~22°C）下放置 24 小时，然后进行相应的储存。分别在 0 和 24 小时随机抽取 40 个接种苹果，以确认初始细菌水平和接种的均匀性。

苹果的贮藏处理

        接种后 24 小时的苹果被随机装入塑料箱中；每箱 40 个苹果。将盒装接种过的苹果随机分成6组，其中一半在贮藏前用1.0 mg/L 1-MCP气态空气处理24 h。然后将苹果置于冷冻空气 (RA; 0.2 ± 0.1°C) 和 CA (0.2 ± 0.1°C, 3.1 ± 0.0% O 2 , 0.4 ± 0.0% CO 2 ) 中，有或没有 60.2 ± 5.7 或78.7 ± 13.2 μg/L 在半商业 RA/CA 房间（3,200 ft 2）在商业设施（Stemilt Growers LLC，Wenatchee，WA，United States）中的相对湿度约为 90%。臭氧气体由商用臭氧发生器产生，并通过比例-积分-导数算法自动转移到储存室，以在储存期间将臭氧剂量保持在目标水平。臭氧浓度在储存的第一周开始，在第四周开始时达到目标浓度。同时，分离的未接种苹果组被包括在上述储存条件中，用于居民微生物区系计数和苹果品质评价。

        接种后的苹果在储存 3、6、12、18、24、30 和 36 周后取样，用于L. innocua计数。在储存 6、12、24 和 36 周后对未接种的苹果进行取样，以测定总平板计数 (TPC) 和酵母/霉菌计数。苹果质量属性在收获时和储存 6 个月和 9 个月时进行评估。每个贮藏条件下每个时间点取样 40 个苹果用于微生物计数、质量属性和内部紊乱评价，而每个贮藏条件下每个时间点采样 100 个苹果用于外部紊乱评价，其中每个苹果被视为一个实验单元。

无害李斯特菌枚举

将每个苹果转移到装有 10 ml 无菌 1 × PBS 的胃袋（Fisher Scientific）中，并用手揉搓 80 秒。摩擦溶液用无菌 1 × PBS 连续稀释 10 倍，铺在 TSAYE 板上，然后覆盖改性牛津琼脂 (MOX) (BD) 以区分李斯特菌和背景细菌（Shen 等人，2019 年），并在37°C 48 小时。L. innocua在 MOX 琼脂平板上产生典型的黑色菌落，周围有黑色晕圈。对于低于检测限（10 CFU/苹果）的样品，将 1.0 ml 摩擦溶液在缓冲的李斯特菌富集缓冲液 (BLEB) (BD) 中在 30°C 下富集 48 小时；李斯特菌的存在/不存在已经报道。将富集培养物分别划线到 MOX 和 CHROMagar TM 李斯特菌（CHROMagar，Paris，France）平板上，以定性检测李斯特菌的存在（Sheng 等人，2017 年）。在每个时间点，每个存储方案的样本大小为每次复制 10 个苹果，每个存储方案有四个独立的复制。

居民微生物群计数

未接种苹果的处理方式与接种苹果相同。将适当稀释度的摩擦溶液分别铺在重复的 TSAYE 板和马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA; BD) 板上，用于 TPC 和酵母/霉菌计数。TSAYE 板在 37°C 下孵育 24 小时，而 PDA 板在室温 (22°C) 下孵育 5 天。在每个时间点，每个存储方案的样本大小为每次复制 10 个苹果，每个存储方案有四个独立的复制。

水果品质分析

根据已发表的方法，在收获时以及冷藏后 6 个月和 9 个月时对未接种苹果的果实质量属性（包括硬度、总可溶性固形物 (TSS) 和可滴定酸度 (TA) 进行了评估（Sheng 等人，2018 年）。简而言之，使用水果质地分析仪（FTA GS-15-643，Güss Manufacturing，Ltd.，Strand，南非）在去皮区域（~3 cm 2) 在每个苹果的阳光照射和阴影面。TSS 含量使用 Atago PR-32 数字糖度折光仪（Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan）测量。果汁的 TA 表示为苹果酸含量的百分比（每 100 克苹果鲜重的苹果酸克数），并使用电位滴定仪（Titrando 888 和 875 Robotic USB Sample Processor XL, Metrohm, Riverview, FL, United状态）。苹果质量分析使用了每次重复 10 个苹果的样本量，每个存储方案有四个独立的重复。

水果障碍分析

在收获时和冷藏 6 个月和 9 个月后检查水果是否有外部疾病。外部疾病包括臭氧烧伤（苹果暴露侧的表面凹坑）、表面烫伤（皮肤上的棕色斑块和变色）、皮孔腐烂（皮孔周围的深棕色凹坑）、腐烂（可见的菌丝体或孢子团）、赤褐色（在皮肤）和 CO 2损伤（皮肤上的雪花样斑块）按照先前描述的标准标准进行目视检查（Sheng 等人，2018 年）。软烫伤，特征是苹果表面有光滑或不规则形状的棕色损伤（DeEll，2013)，也进行了评估。苹果被切片 3 次，用于评估内部疾病，包括水核和内部褐变。Watercore 的特点是富含山梨糖醇的液体在与脉管系统相邻的肉的细胞间隙中积聚（Marlow 和 Loescher，1984 年）。内部褐变的特征是通常起源于核心区域附近的果肉变褐色（Argenta 等，2001）。结果报告为每个贮藏期内单独处理中的苹果与各自的无序/总苹果 (%)。内部紊乱评估使用每个重复 10 个苹果的样本大小，每个储存方案有四个独立重复。对于外部紊乱评估，每个存储方案使用 100 个苹果的样本大小。在室温 (22°C) 下 1 天和 7 天后对苹果进行评估。

统计分析

使用 IBM SPSS 19.0 (Chicago, IL, United States) 分析数据。通过单向方差分析 (ANOVA) 识别平均差异，然后进行 Tukey 多重比较测试。p < 0.05 的值被认为具有统计学意义。

图所示。红鲜苹果商业冷藏36周内无毒蜱的存活研究。a - cMean在没有公共字母的各采样点上差异显著(p < 0.05)。平均值±SEM, n = 32-40。MCP，苹果在冷藏前用1-MCP处理;CAHighO3, CA储存，气体O3持续施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA储存时连续施加气体O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP处理苹果;CAMCPLowO3, CA储存时连续施加气体O3(60.2±5.7 μg/L)，苹果在冷藏前用1-MCP处理。

图在商业冷藏的36周内，红美味苹果上的驻留细菌。a,b不带公共字母的各采样点均值差异显著(p < 0.05)。均值±SEM, n = 40。MCP，苹果在冷藏前用1-MCP处理;CAHighO3, CA储存，气体O3持续施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA储存时连续施加气体O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP处理苹果;CAMCPLowO3, CA储存时连续施加气体O3(60.2±5.7 μg/L)，苹果在冷藏前用1-MCP处理。

结论

经过 9 个月的商业 RA 或 CA 储存，Red Delicious 苹果上的无害乳杆菌计数减少了 ~2 log CFU/苹果。在60.2–78.7 μg/L 的连续低剂量臭氧气体处理下，无害乳杆菌的减少量增加了 1,000 倍；> 5.0 log 10 CFU/苹果在储存 24 周后减少。此外，与无臭氧气体的 CA 储存相比，在 CA 储存中应用低剂量气态臭氧可延缓常驻微生物群的生长，延缓苹果硬度损失，改善苹果品质，并且对 Red Delicious 苹果的外部疾病没有负面影响。因此，低剂量的连续气态臭氧应用是苹果行业控制李斯特菌的一个有前景的策略。和 Red Delicious 苹果上的微生物腐烂。需要进一步研究不同臭氧用量和苹果品种，以确保新鲜苹果的安全和质量。